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        文献解读 | 外泌体lnc-Sox2ot促进肿瘤组织上皮间充质的形成和参与调节肿瘤源性间充质干细胞表型多样性的特点

        2018-06-21

        胰腺导管腺癌细胞分泌的外泌体lnc-Sox2ot充当内源竞争性RNA-ceRNA,促进肿瘤组织上皮间充质(EMT)的形成和参与调节肿瘤源性间充质干细胞表型多样性的特点

        Tumor-derived exosomal lnc-Sox2ot promotes EMT and stemness by acting as a ceRNA in pancreatic ductal adenocarcinoma

        研究背景:外泌体中携带着各种小分子蛋白,小RNA,DNA碎片等物质,广泛参与机体内环境中细胞与组织间或细胞与细胞间的信息交流。因而,外泌体在肿瘤微环境中的信息交流过程中发挥了不可忽视地作用。因而,本研究发现PDAC肿瘤细胞分泌的外泌体一方面可以随血液运行进入血液循环系统定植在血运丰富的组织如肝脏等部位,另一方面可以在肿瘤源性间充质干细胞和肿瘤细胞间进行信息交流,调节肿瘤细胞内参与EMT形成的相关信号分子的改变及诱导肿瘤源性间充质干细胞表型的改变,使肿瘤组织内的上皮细胞具有间充质细胞的生物学特点,能够更强的降解细胞外基质及更易于发生侵袭和转移。


        本研究作者首先通过PDAC细胞系鉴定出了外泌体lnc-Sox2ot等一系列LncRNA外泌体,同时,结合临床血样分析,发现外泌体Lnc-Sox2ot和AK296146是肿瘤细胞分泌最多的两个外泌体;于是,通过将患者临床参数与外泌体Lnc-Sox2ot的表达水平进行COX回归分析和Kaplan-Meier生存分析,发现外泌体Lnc-Sox2ot的表达水平与患者的肿瘤分期TNM成正相关性,而与生存期(OS)成负相关性;


        其次,通过PDAC的细胞系体外实验发现外泌体Lnc-Sox2ot可调节Sox2的表达水平,而促使EMT的形成使肿瘤细胞易于发生侵袭和转移及调控肿瘤源性间充质干细胞多样性,然而,通过生信分析发现Lnc-Sox2ot和Sox2具有一段与miR-200s同源结合的区域,因而,体外实验分析了Sox2调节 EMT的形成及调控肿瘤源性间充质干细胞多样性的特点,同时,结合FISH、荧光素酶、CO-IP和亲和纯化等一系列体外实验发现Lnc-Sox2ot是一个内源竞争性RNA(ceRNA)来结合miR-200c发挥调节SOX2基因的表达,诱导肿瘤细胞上皮间充质(EMT)的形成而促使肿瘤细胞易于发生转移和侵袭及参与调节肿瘤源性间充质干细胞表型多样性,且这一效应在体外动物模型实验中得到了验证。


        最后,通过比较PDAC病人手术切除前后血样中外泌体Lnc-Sox2ot的表达水平变化,确证了外泌体Lnc-Sox2ot是一个判断PDAC病人预后的潜在表型标志物。



        研究方法与结果

        1

        细胞系样品与临床标本筛选并验证靶外泌体LncRNA


        作者首先通过对胰腺导管腺癌细胞株Hs766T和Hs766T-L2的上清分离外泌体,再用 Arraystar Human LncRNA Microarrays V3.0进行微序列分析,得到外泌体中表达的LncRNA,然后通过筛选标准选出30个LncRNA,结果得出只有10个LncRNA在Hs766T-L2中高表达,再对这10个LncRNA进行PCR验证,得到6个目标LncRNA,再结合临床血样进行外泌体鉴定和分析外泌体RNA的表达量,结果筛选出2个表达量最明显的外泌体LncRNA Sox2ot和AK296146。


        接着,结合患者临床信息参数与患者血样中此两个靶外泌体表达量的高低进行COX回归分析和Kaplan-mieier生存曲线分析及单变量和多变量生存分析,结果发现外泌体Sox2ot与患者临床的TNM分期有明显正相关性(P=0.014)且外泌体Sox2ot的高表达与患者的生存期成负相关性,说明高表达的外泌体Sox2ot是患者临床生存预后的一个独立危险因素,由此推断,外泌体Sox2ot是胰腺癌患者诊断和预后评估的一个典型标志物。




        2

        体外实验探究Hs766T-L2, Hs766T细胞系中分离的外泌体的致瘤性特点


        作者通过PDAC细胞系Hs766T-L2, Hs766T和BxPC-3的体外实验,发现细胞系Hs766T-L2和Hs766T分泌的外泌体与细胞系BxPC-3分泌的外泌体比较具有更强的诱导肿瘤细胞发生侵袭和迁移的能力,且这一特点在将分离的外泌体混入肿瘤细胞中后,一起接种于裸鼠模型中得到了验证,同时,进一步通过电镜TEM和WB实验鉴定了此类细胞系分泌的外泌体的大小和表型特征,因而,上述实验的结果充分说明了Hs766T-L2, Hs766T细胞系分离的外泌体有更强的致瘤性。


        3

        通过PDAC细胞系探究了外泌体Sox2ot促进EMT形成和参与调节肿瘤源性间充质干细胞的多样性


        作者通过对PDAC的不同细胞系HPDE、Hs766T-L2、Hs766T、BxPC-3和Capan-1进行分析,发现外泌体Sox2ot在其中都会有表达;然后,构建了一个过表达的Sox2ot慢病毒质粒和低、中、高浓度的siRNA质粒,接种于细胞系BxPC-3中,RT-PCR实验验证了Sox2ot的mRNA的相对表达量;再在细胞系Hs766T、BxPC-3和Capan-1中,用WB实验发现转染过表达Sox2ot质粒的Hs766T细胞系中E-cadherin的表达量下降,N-cadherin和 vimentin的表达量则增加,而在转染si-Sox2ot质粒的Hs766T细胞系中EMT标志物的表达量则相反。


        同时,在肿瘤上皮或间叶细胞源性的细胞系BxPC-3和Capan-1中,进行WB实验也确证了此EMT标志物的表达水平变化特点。同时,在Hs766T细胞系中,通过免疫荧光实验观察并分析了EMT的特点,并且TEM观察了外泌体的大小、粒径表征特点。


        最后,通过免疫印迹试验发现转染过表达质粒Sox2ot的Hs766T细胞系组别中,肿瘤源性间充质干细胞表面标志物:CD133,CD44,ALDH1和Nanog的表达量都上调。


        4

        结合生信分析发现外泌体Sox2ot调节的靶基因是Sox2,因而,探究外泌体Sox2ot调节Sox2的表达来诱导EMT的形成和调节肿瘤源性间充质干细胞多样性的特点:


        首先在Hs766T-L2细胞系中,通过分别转染过表达Sox2ot质粒和si-Sox2ot质粒,WB和RT-PCR实验验证发现细胞系中转染过表达Sox2ot后可以上调Sox2基因的表达,而细胞系中转染si-Sox2ot质粒后,则可下调Sox2基因的表达,且这一结果在细胞系BxPC-3中得到了验证;


        然而,有文献报道Sox2可以促进EMT的形成,因而,展开探究Sox2诱导EMT的形成和调节肿瘤源性间充质干细胞多样性的特点:


        通过构建过表达Sox2ot质粒(ov-Sox2ot质粒)和si-Sox2ot质粒于细胞系Hs766T中,WB结果发现细胞系中转染ov-Sox2ot质粒后,N-cadherin和 vimentin的表达量增加,而细胞系中转染了si-Sox2ot质粒后,E-cadherin的表达量则增加;同样地,在转染ov-Sox2ot质粒的肿瘤源性间充质干细胞Hs766T中,发现其表面标志物表达量也上调。


        由此推断,Sox2ot和Sox2都能调节EMT的形成和肿瘤源性间充质干细胞的多样性,且外泌体Sox2ot能促进Sox2的表达,因而,推测外泌体Sox2ot是否通过调节Sox2基因的表达来诱导EMT的形成和调节肿瘤源性间充质干细胞的多样性。


        于是,通过免疫印迹实验,发现在Hs766T细胞系中,转染ov-Sox2ot质粒后,N-cadherin和 vimentin的表达量上调,而E-cadherin的表达量则下调,且这一特点可以被si-Sox2质粒阻抑,而在细胞系BxPC-3和Capan-1中转染过表达Sox2(ov-sox2),则减弱了si-Sox2ot对N-cadherin和 vimentin表达量的抑制,同样地,在肿瘤源性间充质干细胞Hs766T中,转染ov-Sox2ot质粒后,可以促进其表型标志物CD133,CD44,ALDH1和Nanog的表达,且这一特点可以被si-Sox2阻抑。


        5

        Sox2ot作为内源竞争性ceRNA来结合miR-200c而发挥调节Sox2表达的特点


        通过FISH实验发现LncRNA Sox2ot的转录子在细胞质中的量多于细胞核,通过生信分析工具Miranda,寻找到Sox2ot和Sox2相关联的14个miRNA,通过RT-PCR实验在细胞系Hs766T-L2中进行了验证,发现miR-200c在转染过表达的Sox2ot质粒组中下调,而在转染si-Sox2ot质粒组中,miR-200c的表达量则上调,由此推断miR-200c是研究的靶miRNA,同时,通过生信分析发现Sox2ot包含一段miR-200的3’UTR互补序列。


        于是,构建并转染miR-200c过表达质粒于细胞系BxPC-3中,通过WB实验发现miR-200c可以调节Sox2的表达量,因而,为了确认Sox2ot是否作为内源竞争性ceRNA来结合miR-200,分别构建了psiCHECK2-Sox2ot +miR-200c质粒,psiCHECK2-Sox2ot mut + miR-200c质粒,psiCHECK2-Sox2ot mut+ miR-23a质粒转染于Hs766T细胞中,结果显示psiCHECK2-Sox2ot +miR-200c质粒成剂量正相关性抑制Rluc的表达量,并且,通过免疫共沉淀(CO-IP)实验发现Sox2ot存在于Ago包含的miRNPs中,再通过构建Sox2ot-s1质粒和mut Sox2ot-s1质粒转染于细胞系Hs766T中,运用交联亲和纯化层析分析,发现Sox2ot与miR-200c可以相互作用,且 RT-PCR实验分析了Sox2ot表达量,由此确证了S1 aptamer 成功地与Sox2ot结合了。


        同样地,在细胞系Hs766T中,分别转染Sox2ot-s1质粒和mut Sox2ot-s1质粒于其中,RT-PCR分析了miR-200c和miR-23a的表达量,结果显示Sox2ot-s1可以上调miR-200c的表达,由以上得出:LncRNA Sox2ot作为内源竞争性ceRNA来结合miR-200s而发挥调节SOX2基因的表达;



        6

        体内动物实验研究外泌体LncRNA Sox2ot促进肿瘤侵袭和转移的特点


        首先作者将两组细胞数量为106数目且标记有荧光的BxPC-3细胞,一组转染ov-sox2ot质粒,另一组不做处理,分别接种于5-6周龄雄性裸鼠胰头,每周原位检测其荧光密度来判断外泌体的致瘤性特点,结果发现,在2-3周期间,接种含ov-sox2ot质粒的肿瘤细胞的裸鼠腹部区间肿瘤细胞数量增加,且更易诱发肝脏转移,且一个月处死后,尸检和HE染色也发现含ov-sox2ot质粒的肿瘤细胞的裸鼠中诱发的胰腺肿瘤体积更大,且在肝脏有更广泛的转移灶,因而,说明外泌体sox2ot提高了胰腺导管腺癌细胞的定植和肝脏转移能力。

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